westernblot实验步骤
组织(小鼠十二指肠)蛋白提取 准备:研磨珠、离心管、生理盐水、RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂,磷酸化蛋白酶抑制剂,移液枪,枪头,手套,冰,涡旋仪,4℃离心机;在RIPA蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂(根据说明书确定加入量)2.研磨:提前在离心管中分装300μLRIPA蛋白裂解液并放入2颗研磨珠,称取100mg左右样品,置于匀浆机中充分研磨;3. 蛋白裂解:将样品置于冰上裂解2h,期间于涡旋振荡器上震荡2-3次;4. 蛋白收集:将裂解后的样品4℃12000rpm离心10min,取上清置于新的EP管中备用。
谁能详细地说一下southern blot的的原理和有什么应用吗?
1、原理:Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。其基本原理是:具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下,可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段,将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA分子的含量。2、应用:(1)遗传病诊断;(2)DNA图谱分析;(3)检测样品中的DNA及其含量:先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片段长短进行分离,然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。(4)PCR产物分析。扩展资料Southern印迹杂交技术的过程:Southern印迹杂交技术包括两个主要过程:一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,即印迹(blotting);二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火,即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的,Southern印迹杂交故因此而得名。早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后,经毛细管的虹吸作用,转移到硝酸纤维膜上。印迹方法如电转法、真空转移法;滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜(如APT、ABM纤维素膜)等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析(RFLP)等。参考资料来源:百度百科-Southern印迹杂交技术
westernblot原理及过程
westernblot原理及过程如下:Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品,转移到固相载体上,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。原理:先制备蛋白质样品,再利用SDS-PAGE原理,分离不同的蛋白质,再将分离的蛋白质进行转膜,以便固定在新膜上进行抗原-抗体结合。用固定在膜上的蛋白质作为抗原与对应的非标记抗体结合。由于此过程中,可能有未结合到抗原的抗体遗留,故需要清洗,以便保存特异性结合的抗原-抗体结合物。抗原抗体结合物暴露出一个Fc片段,相应的二抗可以结合到这个片段上,形成抗原-一抗-二抗结合物。再用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记到二抗上,由于加入的标记物相对质量分子很大,可以用离心作用将其沉淀下来,如果抗原与抗体结合,便可以一起沉淀下来,最后通过显色反应或放射自显影法便可检测凝胶中的蛋白成分了。