如何提质粒？
方法一：试剂盒 速度快纯度高污染小。可以买回来看说明书。
方法二：人工提取 比较复杂污染相对高。但是便宜且随时可以操作。简述如下：
1. 接菌。将适量菌体接入含有相同抗性的LB培养基中，37°C摇床培养过夜。
2. 将菌液4000r/min离心1min，弃掉上清
3. 加150微溶液1悬浮细胞，静置10分钟
4. 加200微溶液2（必须新鲜配制），轻轻混匀，至液体清亮。
5. 上步操作5min之内加入溶液3，混匀。冰上15min。
6. 12000r/min离心10min，小心吸出上清转移到另一个小指管中。弃掉沉淀的蛋白。
7. 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），漩涡混匀，12000r/min离心5min，上清转移到另一小指管。
8. 加等体积氯仿：异戊醇（24:1），漩涡混匀，12000r/min离心10min，上清转移到另一小指管。
9. 上清中加2倍体积无水乙醇，混匀后室温30min。12000r/min离心10min，吸去上清。
10. 用1ml的70%乙醇洗涤沉淀2次（每次12000r/min离心5min）。吸去上清后，烘干或者空转，直至沉淀透明
11. 加20微的RTE（含有RNA酶的TE缓冲液，没有的话无菌水也可以），溶解质粒DNA，-20℃保存。
呼呼手打好累。溶液123的配方网上应该都有的吧。没有我再给你打。另外我们一般不图纯度的话，不用什么酚氯仿异戊醇的，直接用70%乙醇洗两次也可以，感觉没太大影响。
提质粒步骤
质粒提取主要包括三个步骤：1、菌体扩繁。2、菌体裂解释放质粒DNA。3、质粒DNA的分离与纯化。质粒提取办法中，最常用的是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特色。其原理是：强碱（pH12.0-12.6）环境下，SDS损坏细胞壁并裂解细胞，一同使宿主细胞的蛋白质、染色体及DNA发生变性，而质粒DNA因为其分子量小而缠结严密不易变性。pH调至中性时可恢复天然构象，在高盐条件下，细胞碎片、变性的蛋白质和染色体DNA发生沉积，离心后可去除。上清中的质粒DNA可经过乙醇沉积或许硅胶膜特异性吸附等方法，将质粒DNA从上清中回收。
碱裂解法提取质粒三种溶液的作用
溶液Ⅰ：葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性；可添加RNaseA消化RNA。 溶液Ⅱ 此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。这一步要记住两点： 第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断也会慢慢断裂； 第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。 溶液Ⅲ 溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS。 因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。 2M的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。 75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上。
碱裂解法制备质粒dna时，溶液1，2，3中各组分都起什么作用
碱裂解法制备质粒DNA时，溶液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ中各组分的作用：1、溶液Ⅰ：葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性；可添加RNase A消化RNA。2、溶液Ⅱ此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断也会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。3、溶液Ⅲ溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS。因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上。扩展资料质粒抽提的窍门（1）加溶液II（裂解液）后，操作一定要温和，剧烈混合会导致基因组DNA污染。（2）洗脱时60℃温育（Ellution Buffer）洗脱缓冲液或去离子水效果更好。（3）若质粒提取含量低，可增加菌液样或换用ArtMedia Plasmid Culture，其比LB培养基质粒得量高。（4）菌体应彻底悬浮 ， 如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成难以完全裂解的团块。这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。（5）加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。（6）中和的操作 ，在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好。参考资料来源百度百科-质粒抽提
质粒提取的注意事项
1、利用氯霉素抑制染色体的复制，而不抑制质粒的复制这一特点，在低拷贝质粒（如pUC19）的培养过程中添加氯霉素可以大大提高得率。2、RNA的去除，首先是使用RNase消化。在溶液I中加入高浓度的RNaseA(100ug/ml)，或者用含25ugRNaseA/mlTE溶解抽提好的质粒，都可以降低RNA残留，但都不能彻底去除。3、蛋白质的去除，主要是靠不溶解的K-SDS-蛋白质复合物的形成。虽然将中和后的体系置于4C一段时间，可以形成更多的该不溶复合物，从而使蛋白质残留更少，但实践证明这样做并不是必须的，除非是大量抽提。首先，质粒的提取可分为质粒小提、质粒中提、质粒大提。目前大多数实验室都选用试剂盒进行提取，可以根据实验的不同需求，选择相应的试剂盒。质粒小提主要用于用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，获得的质粒可以用于常规的载体构建，一般适用于5ml以下菌液。而质粒中提，在小提的基础上可以进一步去除菌液中的内毒素，获得的质粒可以用于细胞转染，常规需要菌液量为10-15ml。质粒大提与中提方法相同，可一次抽提100ml-300ml菌液获得大量质粒。扩展资料质粒提取的原理：质粒抽提的步骤原理即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。最常用的方法是碱裂解法,即在强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来，并发生变性。在pH中性，并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，在去垢剂SDS作用下，染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后。再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。优点为操作过程简单，快速，获得质粒浓度高，目前被广泛使用。参考资料来源：百度百科-质粒抽提
质粒提取的注意事项
1、利用氯霉素抑制染色体的复制，而不抑制质粒的复制这一特点，在低拷贝质粒（如pUC19）的培养过程中添加氯霉素可以大大提高得率。2、RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低 RNA 残留，但都不能彻底去除。3、蛋白质的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白质复合物的形成。虽然将中和后的体系置于 4C 一段时间，可以形成更多的该不溶复合物，从而使蛋白质残留更少，但实践证明这样做并不是必须的，除非是大量抽提。首先，质粒的提取可分为质粒小提、质粒中提、质粒大提。目前大多数实验室都选用试剂盒进行提取，可以根据实验的不同需求，选择相应的试剂盒。质粒小提主要用于用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，获得的质粒可以用于常规的载体构建，一般适用于5ml以下菌液。而质粒中提，在小提的基础上可以进一步去除菌液中的内毒素，获得的质粒可以用于细胞转染，常规需要菌液量为10-15ml。质粒大提与中提方法相同，可一次抽提100ml-300ml菌液获得大量质粒。扩展资料质粒提取的原理：质粒抽提的步骤原理即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。最常用的方法是碱裂解法,即在强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来，并发生变性。在pH中性，并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，在去垢剂SDS作用下，染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后。再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。优点为操作过程简单，快速，获得质粒浓度高，目前被广泛使用。参考资料来源：百度百科-质粒抽提
