western-blot中分离胶的浓度怎么选择
western-blot中分离胶浓度的选择取决于目的蛋白分子量。不同的分离胶浓度对不同的目的蛋白分子量的分辨率不一样，比如15%的分离胶更适合45kDa的分目的蛋白，而10%的分离胶更适合70kDa的目的蛋白。而因为western blot的膜应该是完全覆盖SDS PAGE的凝胶，所以不用太担心条带在凝胶上位置偏上活偏下。所以western blot中分离胶浓度的选择取决于目的蛋白分子量。具体可以参考下表
western-blot中分离胶的浓度怎么选择
溴酚蓝跑到胶的底部为准，26kD在10%的由下往上1/4的地方，而15%就在由下往上大约1/2（不太确定）的地方，对于分子量比较小的蛋白，胶的浓度越大，分离效果越好。但是必须考虑到，胶的孔径一旦小于蛋白-SDS复合体的直径，分子量大于这个蛋白的所有蛋白仍然不能有好的分离效果。如果孔径太大，所有蛋白都跑得那么快，也是分不开的。关键是看这个分子量附近的蛋白，比如±5kD以内的所有蛋白，在不同浓度的胶中的速度差要尽可能达到最大，假设是对数正态分布，那么方差要足够大，才会有较好的分离效果。另一方面，蛋白跑的路程越大，也越能和附近的蛋白分开。扩展资料：在室温15～30℃，相对湿度60%以下，刷胶后的纸边自然吸收反应时间缩短，一股15～30分钟左右分离好；若室温低于15℃(如冬季12月至3月份)，湿度大于60%(夏季)，刷胶后的纸边自然吸收反应时间延长，一般30～50分钟，才能达到最佳分离效果。若室内温度低于15℃或相对湿度大于60%刷胶后的纸边自然吸收反应肘间长，影响后序加工时，可采取先将刷胶后的纸样静置30分钟，用热风吹拂(注意不要离刷胶部位太近直吹，防止吹裂)加速纸边的快速吸收反应，也能达到自动分离效果。(不能刷胶后立即用热风吹拂，分离胶与纸的涂层需要一定时间的接触反应。)在使用分离胶时，务必在印刷品切边后立即刷胶；4～8小时后刷胶，分离效果会明显变差，隔日效果更差因涂胶量不合适或刷胶不均匀(操作生疏)造成的分离效果不好时，必须重新切去刷胶纸边1至2毫米后，再重新刷分离胶。使用分离胶时，务必保证刷胶纸边吸胶均匀；满足所需的干燥时间(若纸边潮湿就检查分离效果会导致脱页或裂口)。分离胶室内保存一般不低于半年。参考资料来源：百度百科-分离胶
western blot原理是什么？
Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。相关如下原理：先制备蛋白质样品，再利用SDS-PAGE原理，分离不同的蛋白质，再将分离的蛋白质进行转膜，以便固定在新膜上进行抗原-抗体结合。用固定在膜上的蛋白质作为抗原与对应的非标记抗体（一抗）结合。由于此过程中，可能有未结合到抗原的抗体遗留，故需要清洗，以便保存特异性结合的抗原-抗体结合物。抗原抗体结合物暴露出一个Fc片段，相应的二抗可以结合到这个片段上，形成抗原-一抗-二抗结合物。再用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记到二抗上，由于加入的标记物相对质量分子很大，可以用离心作用将其沉淀下来，如果抗原与抗体结合，便可以一起沉淀下来，最后通过显色反应或放射自显影法便可检测凝胶中的蛋白成分了。
western blot原理是什么？
Western blot的原理：简单来说原理就是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。Western blot，中文为蛋白质免疫印迹试验，简单来说是抗原抗体特异性结合。Western blot结果中背景较高的原因及建议：膜封闭不够—延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。一抗稀释度不适宜—对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育的温度偏高—建议4℃结合过夜。膜在实验过程中干过—实验过程中要注意保持膜的湿润。检测时曝光时间过长—减少曝光时间。
