路由器要选什么模式，
路由器有五种模式，可以根据自己需要选择模式，参考如下：1、热点模式这种模式是WIFI无线路由早期的典型工作模式。这种模式下WIFI无线路由的配置比较简单，只需配置无线SSID和安全策略即可。此时本机不具备路由功能，纯粹只相当于一个带无线接入功能的交换机。它能实现有线和无线多个设备的局域网接入。为了避免和前端网络设备的DHCP冲突，通常会关闭本机的DHCP功能。用户设备的IP地址和DNS地址需要手动配置或通过前端的DHCP自动分配2、无线路由模式这种模式是WIFI无线路由在家庭的典型工作模式。这种模式下机器除具有接入交换机功能外还具备路由功能。此时有线口中应该有一个为WAN口，用于和ADSL Modem或小区有线宽带相接。本机能使用PPPoE协议自动登录进入ISP提供的Internet接入。多个用户设备可通过无线接入本机网络后共享Internet连接。这种模式下需要配置无线SSID、无线安全策略、WAN口连接方式。通常本机的DHCP功能需要开启，所有接入用户设备的IP地址和DNS地址等通过本机的DHCP自动分配。3、中继模式这种模式用于扩展热点AP接入或无线路由接入模式的无线信号覆盖范围。这种模式需要设备支持WDS（Wireless Distribution System即无线分布式系统）。它是利用设备的无线接力功能，实现无线信号的中继和放大，并形成新的无线覆盖区域，最终达到延伸无线网络的覆盖范围的目的。此时SSID、安全策略和通讯信道都必须保持和前端无线路由一致，网内有线、无线的接入控制基本由前端无线路由确定4、桥接+热点模式这种模式同样用于扩展热点AP接入或无线路由接入模式的无线信号覆盖范围。这种模式需要设备支持WDS。它利用设备的桥接功能，首先设备与前端无线网络建立无线连接，然后自身发出无线信号，形成新的无线覆盖范围，可以有效地解决信号弱及信号盲点等无线覆盖问题。这同样相当于将前端无线路由器的无线或有线接入范围进行了物理距离的延长。5、客户端模式这种模式相当于一个不需要驱动的无线网卡。可用于不具有无线网卡的用户设备用来连接无线AP或无线路由。从某种意义上讲这种情况其实就是单方面的桥接。这种情况下本机不再提供无线AP功能。为了避免和前端网络的DHCP冲突，通常会关闭本机的DHCP功能
无线路由器工作模式怎么选择好？
无线网设置时有“工作模式“应该选择多个字母的。n的连接速度最大能达到300Mbps，g的连接速度最大能达到54Mbps，b的连接速度最大能达到11Mbps，多个字母表示能同时支持多个速率当然越快的越好。因为有些设备支持不同的网络协议，11bgn mixed涵盖了这几种模式，所以选择它就好。11N 暂时是当前最高的，802.11b，特点：2.4GHz频段（跟无绳电话、蓝牙、微波炉一样频段，造成干扰），传输距离：室外300米，室内100米，功耗高,最大传输速度11Mb/s，实际速度5Mbps左右。扩展资料：11bgn mixed的优势：11bgn mixed为802.11B/G/N兼bai模式du，它可zhi以dao根据对方zhuan的网络模式在这这3种模式中自动shu选择，因此其最高容速率可以达到150M或300M；11bg mixed为802.11B/G兼容模式，可以根据对方的网络模式在这这2种模式中自动选择，因此其最高速率可只有54M；在覆盖范围上，由于N模式需要较强的信号，如果工作在该模式下其覆盖范围较小，而后者的范围就较大。
如何对提取的DNA纯化
质粒DNA的提取、纯化和电泳检测
摘要
本实验通过碱变性法提取E.coli DH5α(pUC19)的质粒DNA,并且通过一系列的分离纯化技术将其质粒DNA与染色体DNA、RNA、蛋白质等杂质分开从而得到纯化的质粒DNA分子。通过琼脂糖凝胶电泳可以通过DNA条带的位置来大致判断其分子大小,也可以将实际电泳的结果和理论结果相对比,分析差异产生原因,从而完善实验方法,严谨实验步骤。
关键词碱变性法分离纯化技术琼脂糖凝胶电泳
引言
质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至200kb以上不等。一些质粒永远独立于染色体之外,另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前,已发现有质粒的细菌有几百种,已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(DNA)。质粒在基因工程中是一类重要的载体,其作用主要是携带一些基因片段(可以是编码基因,也可以是调控区等),在细胞内环境中进行表达或参与通路的相互作用,通过将质粒转化到宿主细胞可以探究基因相互作用关系,取得蛋白产物,实现特定基因片段的克隆等。总之,质粒在生物科学研究方面具有广泛的作用。
提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-***化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中,碱变性提取法最为经典和常用。碱裂解/碱变性法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的分离方法。在pH12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA恢复原来的构型,保存在溶液中;染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,通过离心被除去。最后,质粒DNA用冰乙醇沉淀获得。由于DNA和RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白,可通过酚/***仿抽提除去,最后获得纯度较高的质粒DNA。
电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下,可以解离成带电荷的离子,在电场中会向相反的电极移动。凝胶电泳是分子生物学的核心技术之一。凝胶是电泳支持介质,具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中,其中的电离子会发生移动,此时移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动
速度差异,就可以区别各种大小不同的分子。因而,凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。
正文
1.材料和方法
1.1材料和试剂
实验材料:E.coli DH5α(pUC19)。
实验试剂:LB液体培养基、氨苄青霉素(Amp)母液(储存浓度100mg/mL)、溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mM EDTA (pH 8.0);溶液Ⅱ:0.2MNaOH,1% SDS;溶液Ⅲ:5MKAc(pH 4.8);TE溶液:10mM Tris-HCl,1mM EDTA (pH 8.0);冰乙醇、70%乙醇、RNase A、Tris饱和酚、***仿/异戊醇混合液、酚/***仿/异戊醇(PCI)(25:24:1)混合液、3M NaAc溶液、灭菌双蒸水ddH2O、50×TAE缓冲液、10mg/mL溴化乙锭(EB)溶液、6×上样缓冲液(6×loading buffer)。
1.2实验方法
大肠杆菌的增值
用牙签从LB固体培养基挑取E.coli DH5α(pUC19)菌落于LB+Amp(Amp工作浓度为100μg/mL)液体培养基中,置于37℃、200rpm培养箱下振荡过夜培养。
实验前准备
(1)用搪瓷杯取一杯冰。
(2)将小烧杯放在天平上,调至平衡。
(3)配置80ml溶液Ⅱ: 将原液10M NaOH,10% SDS配制成0.2M NaOH,1% SDS。取用8ml SDS,1.6ml NaOH和70.4ml蒸馏水配置。
3. E.coil菌株的收获( 4°C操作)
(1)取一个灭菌离心管,称重,标记为W1 14.552g
(2)倒入菌液至距瓶口1/3处,两两配平
(3) 6000rpm,离心5min,弃上清
(4)加入5ml 溶液Ⅰ,涡旋, 6000rpm,5min,弃上清,称重为W2 14.676g,计算W2-W1 0.124g。
4.细胞裂解提取质粒DNA ( 4°C操作)
向菌体沉淀中量加入(按菌体量接近的重新分组,溶液Ⅰ补平)
(1)2.0 mL 溶液Ⅰ,充分涡旋振荡;用溶液Ⅰ再次配平
(2)4.0 mL溶液Ⅱ,轻柔颠倒混匀,冰浴3-5mi
(3)3.0 mL 溶液Ⅲ,轻柔颠倒混匀,冰浴5mi
(4)12000rpm, 15min;小心转移上清到新的离心管内,记录体积V。
(5)加入2V冰乙醇,颠倒混匀;-20℃,15min;。
(6)12000rpm,15min,弃上清。
(7)加入5mL70%乙醇,12000rpm,3min,吸弃上清。
(8)重复乙醇洗涤一次;37℃风干5-10min。
(9)分次加入0.5mL TE溶液两次,将沉淀吹开吹匀,并移到Ep管中,得质粒DNA粗提物
(10)加入5μl RNase A(10mg/ml),终浓度为50μg/mL,37℃孵育1-2小时。
5.质粒DNA的纯化
将1mL质粒DNA粗提物分出500μL到一新EP管中,使得每组两管。每个EP管进行如下操作:
(1)加入等体积的Tris饱和酚,涡旋振荡,12000rpm,5mi
(2)转移上清V1(两管均为400μL)至新管,加入V1的酚/***仿/异戊醇混合液,涡旋振荡(<1min),12000rpm,5mi
(3)转移上清V2(一管为400μL,一管为378μL)至新管,加入V2的***仿/异戊醇混合液,涡旋振荡(<1min),12000rpm,5mi
(4)转移上清V3(两管均为250μL)至新管,加入1/10 V3的3M NaAc溶液(pH=5.2),再加入2V4(V4=V3+1/10V3)的冰乙醇,震荡混匀,-20℃保存30mi
(5)12000rpm,15min,弃上清
(6)加入500μL 70%乙醇洗涤,12000rpm离心2min,弃上清
(7)重复洗涤一次,吸弃上清,37℃风干5mi
(8)每管加入25μL TE溶解沉淀,合并,得50μL纯化质粒DNA。
6. 1% 琼脂糖凝胶的制备
(1)配制2L 1×TAE:取40mL 50×TAE,用双蒸水将其稀释至2L
(2)正确组装制胶槽、制胶板、样品梳
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文档介绍：
(3)取40mL 1×TAE至250mL干净红盖瓶中,称量0.4g琼脂糖,混匀,轻旋瓶盖,微波炉加热沸腾3-4次,至溶液澄清无颗粒
(4)待溶液冷却至60℃左右,加入20μL 1mg/mL的溴化乙锭(EB)溶液,使EB溶液终浓度为0.5mg/L,混匀后倒入制胶槽中,冷却凝固待用(冷却凝固时间要在30min以上)。
7.电泳上样
(1)取2.0μL纯化DNA、2μL双蒸水、1μL上样缓冲液(6×loading buffer),用微量移液器吹吸混匀
(2)将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中,添加1×TAE至高出胶面约1mm
(3)将上述混合好的DNA样品,按照下表顺序,点样到凝胶中。。
8.凝胶电泳与DNA分离
(1)开启电泳仪电源,选择合适的电压120V和时间40mi
(3)将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极,与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极,与电泳仪负极相连
(4)启动电泳,待观察到负极有气泡升起方可离开
(5)电泳结束,关闭电源,取出凝胶,在紫外灯下观察电泳条带。
2.实验结果
表 DNA样品加样顺序
泳道
DNA
样品/
marker
超螺旋marker
UC19
UC19/HindⅢ
1组DNA样品
2组DNA样品
3组DNA样品
4组DNA样品
5组DNA样品
超螺旋marker
样量
6μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
6μL
泳道
10
11
12
13
14
15
16
17
DNA
样品/
marker
6组DNA样品
6组DNA样品(阳性对照)
7组DNA样品
8组DNA样品
9组DNA样品
10组DNA样品
UC19
HindⅢ
UC19/
样量
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
5,026
5,026
3,049
2,087
图碱裂解法提取质粒pUC19 DNA的琼脂糖凝胶电泳
泳道1与泳道9 加的样品是Supercoiled DNA Ladder Marker。supercoiled DNA Ladder Marker 由8种超螺旋的质粒DNA 构成,DNA大小分别为:2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp、5,026 bp、6,133 bp、8,023 bp、10,085 bp、11,849 bp。其中5,026 bp的条带最亮。
泳道2与泳道17加的样品是pUC19质粒。DNA,即超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA,其条带在2.7kb左右,起对照作用。
泳道3与泳道16加的样品是用HindⅢ酶切的pUC19质粒。HindⅢ酶切pUC19的结果是使超螺旋的共价闭合环状结构的pUC19质粒DNA的链断裂成线状的DNA, 线状DNA电泳速率减慢。但是实验中所用的HindⅢ没有将pUC19酶切充分,因此泳道3与泳道16电泳后会形成两条条带,其中暗带是被HindⅢ酶切的pUC19 质粒,明带是没有被HindⅢ酶切的pUC19质粒。
泳道11是没有加RNase的对照组的电泳图像,由于RNA易形成各种高级结构,同样大小的DNA和RNA相比,RNA的电泳速率快。泳道11下方的大量明带即为RNA电泳区域。
除了泳道15存在pUC19质粒所在区域条带,其他组的都无或无明显的pUC19质粒所在区域的条带,包括泳道15在内的所有组的条带位置都偏低,因为碱变性法有缺陷:容易导致不可逆的变性,不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法,质粒在碱性条件下会变性,时间一长,这种变性就是不可逆的了,我们碱变性时间太长,导致质粒DNA的变性不可逆,所以实际条带位置和预估不一样。
除了位置偏下的质粒DNA带以外,每一组都存在中间位置较弱的杂带(实心箭头所指),我们推测此杂带是没有被沉淀的,在加了有机物后涡旋震荡过程中所产生的线性染色体DNA的碎片,DNA,所以它的位置偏后。这一杂带在泳道4、7、8、10、12和16尤为明显。
个别组在加样孔下方也存在较窄的DNA条带(线性箭头所指),据推测,这种条带的产生是质粒DNA沉淀中少量染色体DNA杂质的存在而产生的,由于染色体DNA片段过大,1%的琼脂糖凝胶的分辨率有限,片段过大的DNA在电泳时速度极慢或很难穿过琼脂糖凝胶的孔径,因此,形成离上样孔近的较窄的杂带。这一杂带在泳道4、7、10和12尤为明显。
个别组在加样孔处也存在较弱的DNA条带(方形箭头末端所指),我们推测可能是没有除尽的蛋白质把加样孔堵住了,导致少数DNA无法从加样孔跑到凝胶当中去。这一杂带在泳道4、7、10和12尤为明显。
我们组的质粒DNA(0.124g)在泳道13,和其他泳道相比,我们的质粒DNA的条带稍微偏弱,这说明我们在组提取质粒DNA时有一定的DNA损失,但是我们组的DNA碎片和染色体DNA杂带也相对较弱,这可能和我们所提取的DNA量较少有关(和泳道4对照,由于此组提取的质粒DNA量较大,所获得的杂带也较明显。因此,不能因为我们组的杂带少而确定我们组的结果好),也有可能是我们的杂质除去得较为充分(和泳道14相比,我们组的杂带明亮程度和他们相近,但是我们的目标带明显比他们亮度高)。
3.讨论
加入5ml 溶液Ⅰ,涡旋的目的是重悬并洗涤菌体。溶液Ⅰ中葡萄糖的作用是为细胞提供等渗环境,
Tris-HCl作为pH缓冲液,为细胞提供适宜酸碱环境,EDTA(pH 8.0时溶于水)是重要金属螯合剂,可以与Mg2+、Ca2+等金属络合,抑制DNase对DNA的降解作用。离心后尽可能去除干净上清液,减少培养基对实验结果的影响。
加入2.0 mL 溶液Ⅰ的作用是重悬并洗涤菌体。
加入4.0 mL溶液Ⅱ的目的:①SDS能断裂分子内和分子间氢键,使分子去折叠,从而破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构而达到裂解细胞的目的。加入溶液Ⅰ后,溶液变得清亮粘稠,变得清亮是由于细胞破碎了,粘稠是由于细胞内蛋白质等有机物析出。加入溶液Ⅰ要慢慢颠倒,使之混匀,不能烈震荡。震荡过于剧烈会使染色体DNA断裂成碎片,导致在质粒DNA中引入杂质。②NaOH的碱裂解作用和碱变性作用:NaOH可以与蛋白质结合(细胞膜含有蛋白质)从而破碎细胞;在pH12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,而质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。因此可通过之后对pH值的调节达到分离染色体DNA与质粒DNA的目的。
此步骤等待时间不能过长,因为强碱也会破坏质粒DNA。
加入3.0 mL 溶液Ⅲ(5M KAc(pH 4.8))的作用是使质粒DNA复性,而染色体DNA太长难以复性从而沉淀出来。不能复性的染色体DNA与
